Regulation und Mechanismus der vom Phagen T4 induzierten Lyse von Wirtszellen

verfasst von

Jan Michel Frederik Schwarzkopf

betreut von

Thomas Brüser

Abstract

Nach einer Infektion mit virulenten Phagen werden die bakteriellen Wirtszellen zur Freisetzung neuer Phagenpartikel lysiert. Bei Phagen mit doppelsträngigem DNA-Genom wird dies durch die muralytische Aktivität von Endolysinen erreicht. Ihr Zugang zur Zellwand wird durch Holine vermittelt, welche Läsionen in der Cytoplasma-Membran erzeugen. Das Protein T des Escherichia-coli-PhagenT4 gehört zu den kanonischen Holinen, die eine Passage cytoplasmatischer Endolysine durch die Membran ermöglichen. Da kanonische Holine in der Abwesenheit von Endolysinen Aggregate und bis zu 1 µm große Läsionen in der Membran bilden, wurde bisher von einer unspezifischen Freisetzung der Endolysine durch große Membran-Löcher ausgegangen. Nach sekundären Phagen-Adsorptionen an der Wirtszelle wird die Lyse durch den Phagen T4 verzögert. Für diese Lyse-Inhibition (LIN) ist die Interaktion von T mit dem Antiholin RI essentiell. Die Kristallstruktur einesin vitro gebildeten T2-RI2-Tetramers umfasste nur die löslichen Regionen der Proteine und lieferte keine Erklärung, wie der Komplex in der Membran verankert ist. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die LIN in E. coli mit einem Vektor-basierten System rekonstituiert und dieses zur In-vivo-Analyse von RI-Varianten genutzt. Obwohl RI ein Signalpeptid besitzt und in das Periplasma freigesetzt wird, wurde die LIN auch mit einer Membran-verankerten Variante vermittelt. Außerdem wurde gezeigt, dass nur eine Interaktionsfläche der Kris￾tallstruktur in vivo relevant ist. T wird daher durch RI in einem Heterodimer inhibiert. Durch eine Untersuchung der Abundanz von RI-Varianten nach Inhibition der Translation wurde nachgewiesen, dass die Signalpeptid-Schnittstelle von RI die Funktion hat, die Konzentration dieses Antiholins zu regulieren. Fluoreszenz-markiertes Holin T wurde mittels Mikroskopie über die Zeit analysiert und anhand dessen gezeigt, dass eine Freisetzung von Endolysinen bereits vor der Entstehung großer Aggregate erfolgt. Durch funktionelle Analysen von T-Varianten, die mittels Missense-Mutatio￾nen und Verkürzungen erzeugt wurden, wurde nachgewiesen, dass die cytoplasmatische Helix des Holins für Erzeugung von Membran-Läsionen essentiell ist. Dies stimmt mit AlphaFold-3-Struktur-Modellen von T-Komplexen überein, in denen eine Transmembran-Orientierung dieser Helix zur Bildung einer Pore mit hydrophiler Innenseite führt. Zusätzlich wurden die AlphaFold-3-Modelle durch Positions-spezifische In-vivo-Cross-Links unterstützt. Die Analysen von T deuten darauf hin, dass das Holin die Lyse durch eine Erzeugung von Poren vermittelt, welche aus kleinen Assemblierungen hervorgehen.

Organisationseinheit(en)

Institut für Mikrobiologie

Typ

Dissertation

Anzahl der Seiten

172

Publikationsdatum

24.06.2025

Publikationsstatus

Veröffentlicht

Elektronische Version(en)

https://doi.org/10.15488/19180 (Zugang: Offen)